Spoiler içeriyor
Film, işsiz ve hayatta bir türlü dikiş tutturamayan hayalperest bir baba olan Larry Daley’nin hikayesini anlatır. Larry, oğlu Nick’le iyi bir ilişki kurmak ister ama sürekli başarısız girişimlere kalkıştığı için hem maddi sıkıntı içindedir hem de Nick’in gözünde güvenilir bir…devamıFilm, işsiz ve hayatta bir türlü dikiş tutturamayan hayalperest bir baba olan Larry Daley’nin hikayesini anlatır. Larry, oğlu Nick’le iyi bir ilişki kurmak ister ama sürekli başarısız girişimlere kalkıştığı için hem maddi sıkıntı içindedir hem de Nick’in gözünde güvenilir bir figür olamamaktadır. Nick annesiyle birlikte yaşamaktadır ve annesinin yeni eşi gayet başarılı, istikrarlı bir adamdır. Larry ise, oğluna örnek olabilmek için nihayet sabit bir işe girmeye karar verir.
Bir dizi başarısız iş başvurusunun ardından Amerikan Doğa Tarihi Müzesinde gece bekçisi olarak işe alınır. Müzenin yaşlı bekçileri Cecil (Dick Van Dyke), Gus ve Reginald emekli olacaklardır; Larry’yi onların yerine işe alırlar. Larry ilk gece işe başladığında, müze tamamen sıradan görünür. Ancak gece yarısı olduğunda inanılmaz bir şey olur: müzedeki tüm sergiler canlanır. Dinozor iskeletleri koşup oynar, vahşi hayvanlar etrafta dolaşır, eski medeniyetlerin heykelleri ve balmumu figürleri konuşur, kısacası bütün müze canlı hale gelir.
Larry panikler. T. rex iskeletiyle kovalamaca yaşar, minyatür roma askerleriyle Amerikan kovboyları arasında savaş çıkar. Mısır firavunu Akhmenrah’ın lahdi açıldığında, sihrin kaynağının Akhmenrah’ın altın tableti olduğu anlaşılır. Bu büyülü tablet, her gece müzedeki tüm sergileri canlandırmaktadır; ancak sabah güneşiyle birlikte herkes tekrar taşlaşır.
Larry ilk gecesinde kaosu durdurmakta zorlanır, sabah müzeyi darmadağın halde bulur ve kovulmanın eşiğine gelir. Fakat oğlu Nick onun yeni işini görmek için heyecanlanmıştır, bu yüzden Larry ikinci gece kendini toparlamaya karar verir. Yaşlı bekçiler ona bazı kurallar verir: asla kimsenin müzeden kaçmasına izin verme, sabah her şeyin yerinde olması gerek. Ancak işler yine karışır. Hun lideri Attila saldırganlaşır, minyatür karakterler birbirleriyle didişir, Neandertaller ateşle oynamaya kalkar. Larry bu canlılara uyum sağlamayı, onları idare etmeyi öğrenmek zorunda kalır.
Zamanla Larry, müzedeki figürlerle dostluk kurar. Özellikle Theodore Roosevelt (Robin Williams), ona liderlik ve sorumluluk konusunda öğütler verir. Roosevelt, Larry’ye oğluna karşı dürüst ve güvenilir olmasını, kendine inanmasını söyler. Larry’nin oğlu Nick bir gece babasına sürpriz yaparak müzeye gelir ve o da mucizeye tanık olur.
Ancak müzede bir sorun ortaya çıkar: sihirli tabletin gücü azalmaya başlar ve bazı sergiler sabah olmadan taşlaşmaya başlar. Larry bunun nedenini araştırırken büyük bir gerçeği öğrenir: emekli bekçiler Cecil, Gus ve Reginald, aslında tabletin gücünü keşfetmiş ve onu çalarak kendi gençliklerini geri kazanmak istemektedirler. Larry’nin işe alınmasının nedeni, onların suçlarını gizleyebilmek için bir “günah keçisi” bulmaktır.
Cecil ve diğerleri tableti çalarak müzeden kaçar. Larry, oğlu Nick’le birlikte müze canlılarının da yardımıyla bir kovalamacaya girişir. Mini askerler, dinozor, maymun Dexter, hatta Attila bile devreye girer. Şehirde eğlenceli bir kovalamaca yaşanır; sonunda Larry ve Nick, yaşlı bekçileri yakalar ve tableti geri alır. Müzeye döndüklerinde sabah olmak üzeredir, herkes tekrar eski haline döner ama Larry artık kahramandır.
Ertesi gün müze ziyaretçileri, sergilerin her zamankinden daha canlı göründüğünü fark ederler çünkü geceki maceranın etkisi hâlâ ortadadır. Müze müdürü Larry’nin işe yaradığını fark eder ve onu işte tutmaya karar verir. Nick ise babasıyla gurur duyar; Larry sonunda oğlunun gözünde kahraman olmuştur.
Film, müzenin gece yarısı yeniden canlanması ve Larry’nin artık bu büyülü dünyaya alışmış bir şekilde arkadaşlarıyla eğlenmesiyle biter.